Odpověď na téma: 42. CP SOČ online – obor 06 zdravotnictví

[Jana Nguyenová]

Dobrý den, vážená poroto,
předně bych chtěla poděkovat za Vaše dotazy. Níže posílám své vypracované odpovědi.

1.Vysvětlete pojem difrakční světlo, viz str. 34.
Difrakce je jev, při kterém dochází k odchýlení světla od přímočarého směru šíření, které nezpůsobuje odraz či lom (jednoduše řečeno ohyb světla na štěrbině nebo překážce). Na difrakčním světle je založen princip kofokálního mikroskopu, neboť „překážka“ v podobě zkoumaného preparátu má velikost srovnatelnou s vlnovou délkou světla. Laserový paprsek je nejdříve zaostřován na clonku, poté prochází objektivem až ke vzorku, kde je obraz clonky zase zaostřen do bodu, jehož průměr odpovídá difrakční mezi, která představuje rozlišovací mez (průměr bodu je tedy roven rozlišovací schopnosti objektivu). Finální difrakční obrazec tak vzniká ohybem zobrazujícího se světla na čočkách objektivu.

2. Výsledné preparáty jste zhotovili za využití montovacího média VectaShield (VectorLaboratories). Lze použít alternativně i jiné montovací médium?
Existuje velké množství komerčně dostupných montovacích médií, které slouží k uložení vzorku pod krycím sklem a jeho fyzické ochraně. Některé typy montážních médií ztvrdnou, aby držely krycí sklíčko pevně na svém místě, a jiné typy používají různá rozpouštědla, jako například vodu, glycerin a xylen, protože skvrny v preparátu vzorku jsou citlivé na konkrétní rozpouštědlo.
My jsme použili VectaShield pro detekci buněčných jader pomocí interkalačního barviva DAPI a detekci přítomnosti molekul peroxidu vodíku pomocí signálu fluorescenčního senzoru HyPer (detekce díky značce GFP vložené do sekvence regulační domény proteinu OxyR v senzoru). Toto médium umožňuje dobrou fluorescenci při zobrazování vzorků buněk. Je obohacen o DAPI (jako tzv. counter-stain pro DNA).
Při výběru montovacího média je tedy třeba vzít v potaz účel jeho použití a funkce média. Montovací média by měla mít v ideálním případě index lomu co nejblíže indexu fixovaného proteinu (přibližně 1,53). Je to z toho důvodu, že jak světlo prochází z jednoho média na druhé, mění svou rychlost a ohyby. Motovací médium s indexem lomu blízkým fixovanému proteinu proto bude transparentní pouze pro obarvené tkáňové prvky. Mezi další komerčně dostupná montovací média, která lze alternativně použít, patří např. ProLong® Gold Antifade Mountant with DAPI (P36935), Flouro-Gel II s DAPI (#17985-50) či DAPI Fluoromount G-Southern Biotech.

3. Uvádíte, že jste buňky oplachovala PBS. Uveďte složení tohoto roztoku, dále postup jeho přípravy a doporučení k jeho uchovávání.
Pro oplach buněk jsem používala PBS, protože velmi dobře napodobuje pH, osmolaritu a koncentraci iontů lidského těla (jedná se o izotonický roztok) a je pro buňky netoxický. Složení roztoku 1xPBS (pH 7,4): NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na2HPO4 (10 mM), KH2PO4 (1,8 mM). Postup přípravy roztoku o objemu 1l: 1) Ve vhodné nádobě si připravíme 800 ml destilované vody. 2) Přidáme 8 g NaCl, 200 mg KCl, 1,44 g Na2HPO4 a 240 mg KH2PO4. 3) Roztok důkladně promícháme upravíme na požadované pH, v našem případě to bylo pH=7,4 (lze upravit např. pomocí HCl nebo NaOH. 4) Do roztoku dolijeme destilovanou vodu do objemu 1 litru. PBS má dobrou skladovatelnost, v přítomnosti iontů zinku se však vysráží. Uchovává se při normální laboratorní teplotě (15°C až 30°C), nedoporučuje se však používat déle než 12 měsíců od data přípravy. Důležité je především nekontaminovat roztok.

Doufám, že se mi podařilo zodpovědět Vaše otázky.

S pozdravem a přáním pěkného zbytku dne
Jana Nguyenová