Odpověď na téma: 42. CP SOČ online – obor 03 chemie

[Martin Havlásek]

1) Navržené mutace mají za cíl stabilizovat celý protein. Na základě simulací rozbalování bylo však zjištěno, že rozbalování začíná právě v této oblastí. Cílem bylo tedy a) stabilizovat přimo vičkovou doménu jako takovou b)zabránit oddělení domén od sebe v raných fázích denaturace. Mutace by tedy neměly mít vliv ma hlavní doménu, kromě menši tendece o oddělení dvou vyskytujicich se domen.
2) Určitě použít lze a tuto metodu (DSC) v LL běžně využíváme pro detailnější analýzy. Kdyby tedy hodnoty naměřené pomoci CD a fluorescence ukazaly vyšši stabilitu některé z variant, jednou z naslednych analyz by byla prave DSC, která však vyzaduje vetsi množství proteinu a bylo by zapotřebí nakultivovat protein znovu, což vzhledem k nepriznivym vysledkum neni v plánu prozatím.
3)Tento přístup v práci nevyužívám, ale předpokládám, že tyto mutace povedou k vyšší rigidyzaci řetězce, což povede k snižení míry volnosti řetězce a tedy žádanému efektu.
4) Použité plazmidy byly, pokud se nepletu, cirkulární
5)Tuhle otázku jsme řešili už několikrát, protože tento trend je patrný v podstatě u vsech HLDs, ktere tvoří vyšši oligomery. Důvodem bude nejspíš vyšši afinita oligomerů k nikelnatym iontum, tudiz k jejich eluci je zapotřebí vyšši koncentrace imidazolu.
6)U CD spektroskopie HlDs používáme vlnové délky 224 a 227 nm, protože rozdil v amplitudě mezi nativnim proteinem a denaturovanym je pro HLds největší právě v této vlnove delce.
7)Pro vytvoření fluorescenčních denaturačnich křivek se dá využít více postupů. Byl vyzkoušen ještě poměr intensit ve vlnovych delkach 350nm a 330nm, ale pro AEW obecně křivky vypadaly lépe a více vystihovaly změny, ke kterym dochazi, tj. S postupným rozbalovanim posun emisniho maxima do vyšších hodnot, což můžeme vidět právě jako rostoucí signál AEW.