Hlavní stránka Fóra Obhajoby 2021 – Královéhradecký kraj 43 – kraj KHK – obor 6 Odpověď na téma: 43 – kraj KHK – obor 6

#27277
Nikola Eva Mádlová
Host

Dobrý den, vážená poroto,

předně Vám chci poděkovat za Vaše podnětné dotazy, zde jsou mé odpovědi.

1. otázka – Jaká byla Vaše úloha při tomto výzkumu? Která část výzkumu je přímo Vaše práce?

Výzkum inovativních ligandů nukleárních receptorů probíhá na Katedře farmakologie a toxikologie Faf UK již řadu let. Obrátila jsem se na prof. PharmDr. Petra Pávka, Ph.D. s prosbou, zdali by nebylo možné se do tohoto výzkumu zapojit a setkala jsem se se souhlasem. Pan prof. Pávek mi zadal problém – najít ligand myšího konstitutivního androstanového receptoru, který bude mít v nejlepším případě inhibiční účinek na tento receptor a bude tak moci být využit jako potenciální protinádorové léčivo po intoxikaci mCAR receptoru xenobiotickými ligandy. Od té chvíle jsem zcela samostatně provedla teoretickou rešerši a na bázi výsledků tetramethoxystilbenu ze studie Dušek et al., 2019 a přímo strukturního vzorce modelového agonisty mCAR receptoru – xenobiotika TCPOBOP vyhledala design látky PP01 na chemickém vyhledávači ChemSpider. Svůj návrh jsem přednesla panu prof. Pávkovi, se kterým jsem následně zkonzultovala, jaké substituenty budou k molekulárními skeletu látky PP01 připojeny. Vznikla tak série látek, jež byly objednány a na Katedře organické a bioorganické chemie Faf UK pod vedením PharmDr. Marcela Špuláka, Ph.D. syntetizovány. Mezitím jsem byla panem prof. Pávkem zaučena, neboť jsem nikdy předtím neměla možnost pracovat v biochemické laboratoři. Po syntéze látek započalo testování, první experiment proběhl pod dozorem mého konzultanta, ty další jsem již provedla samostatně s následnou kontrolou. Chci ale zdůraznit, že všechna měření, jež jsou v práci uvedena, jsem provedla vlastníma rukama. Tudíž přímo mou prací nejsou jen všechna provedená testování, ale zejména design výchozí látky s inhibičním účinkem vyvinuté na bázi xenobiotika TCPOBOP, což nebylo nikdy dříve uskutečněno.

2. otázka – Zkuste nám jednoduchým způsobem popsat princip Dual – Luciferase?

Systém duálních reportérů spočívá ve vložení reportérového plazmidu, tedy kruhové DNA s konkrétním genem (genem pro světluškovou luciferázu) do buňky. Jak už název napovídá, reportérový plazmid je tu proto, aby nám podal informaci o tom, co se v buňce děje, např. jak se buňka chová po přidání konkrétní testované látky. Proto, abychom to zjistili, tak do buňky musíme vložit i konkrétní receptor, náš předmět zájmu, jehož reakce na látku nás zajímá a pro nějž buňka poskytne prostředí. Toto provedeme pomocí vložení expresních plazmidů s genem pro náš receptor – mCAR, pro RXR receptor (bez kterého by mCAR nemohl fungovat a regulovat expresi cílových genů) a také Renilla luciferázu – ta má za úkol nám říci, zdali je všechno jak má být, tedy zdali se povedlo všechny plazmidy úspěšně přenést do buněk a také slouží jako ukazatel cytotoxicity. Cílem je, aby Renilla nebyla látkami ovlivněna a její hodnoty zůstaly vysoké, to totiž bude znamenat, že látky neměly na životaschopnost buněk negativní vliv. Interakci látek s mCAR receptorem nám poté ukáže hodnota světluškové luciferázy (což je protein, který vznikl přepsáním a překladem genu v tom reportérovém plazmidu), která svítí a právě míra jejího světleného signálu je vyhodnocena. Když bude svítit více, znamená to, že látka je agonistickým ligandem mCAR, neboť zvýšila jeho aktivitu, když bude svítit méně, znamená to, že je látka antagonistický ligand mCAR s inhibičním účinkem. Poté je světlušková luciferáza zhasnuta reagentem StopGlow a je přidán reagent, který rozsvítí Renillu. Její světlený signál nám podá informaci o tom, jestli testované látky buňky nepoškodily. Tímto získáme ucelený obrázek o tom, jestli se testovaný ligand na vložený mCAR receptor váže, jak na něj působí a zároveň jestli neničí testované buněčné linie.

S přáním hezkého dne
Nikola Eva Mádlová