Hlavní stránka Fóra Forum pro soutěžící SOČ 42. celostátní přehlídka ONLINE 42. CP SOČ online – obor 03 chemie Odpověď na téma: 42. CP SOČ online – obor 03 chemie

#24388
Hana Bernhardová
Host

Dobrý den, vážená poroto,

Velmi děkuji za Vaše dotazy. Níže přikládám své odpovědi.

Bohužel jsem zjistila, že při předevení souboru do pdf formátu zmizela část grafů v části mutageneze DmmA H315F a já si toho nevšimla. Za tuto chybu se moc omlouvám, nikdy by mě nenapadlo, že pdf convertor může něco takového udělat. Jelikož by takto grafy neměly žádnou vypovídací hodnotu a v prezentaci je horší viditelnost, tak přikládám odkaz na grafy, které jsou kompletní, abyste se mohli přesvědčit, že mé výsledky mutagenete jsou validní: https://drive.google.com/file/d/1ujw9Mg5gXE_w3KO5dcn0e7dKURw9Jgyx/view?usp=sharing

Přeji pěkný den,
Hana Bernhardová

1. Proč halogenalkandehalogenasy nedokáží štěpit vazbu C-F?

Vazba C-F je totiž silnější než vazby k jiným halogenům a není přístupná SN2 reakci, která je nutná pro dehalogenaci. Fluorované deriváty se dokonce používají jako kompetitivní inhibitory halogenalkandehalogenas, jelikož dokážou tyto enzymy inhibovat i při velmi nízkých (milimolárních) koncentracích.

2. Dle jakého klíče byly vybírány ligandy/laktony pro ko-krystalyzace s DmmA?

Cílem mé práce bylo zjistit, jestli se do aktivního místa DmmA dokážou navázat i velké aromatické molekuly substrátů. Substrát BDP byl vybraný nejen kvůli aromaticitě, ale také kvůli tomu, že se jedná o fluorescenční substrát. Fluorescenční substráty jsou totiž velmi cenné při studiu vlastností enzymů (zejména kinetické studie) a lze tak lépe pochopit mechanismus reakce. Konkrétně BDP bylo vybráno, protože v molekulárním modelingu různých fluorescenčních halogenovaných substrátů bylo zjištěno, že by mohlo s DmmA reagovat a navázat se do aktivního místa.
Laktony byly vybrány kvůli studii o možné lakton-dekarboxylasové aktivitě halogenalkandehalogenas. Konkrétní laktony pak byly vybrány tak, aby bylo zastoupeno co nejvíce různých druhů laktonů (beta, gamma, delta) různých velikostí, aby se pokrylo široké spektrum možných substrátů. Pokud by totiž teorie o lakton-dekarboxylasové aktivitě byla platná, tak každý dehalogenasa může být specializovaná na určité laktony.
Azakoelenterazin byl vybrán kvůli podobnosti halogenalkandehalogenas s Renilla luciferasou. Konkrétně enzym DmmA byl vybraný kvůli velkému aktivinímu místu a největšímu potenciálu navázání azakoelenterazinu. DmmA je nyní díky zjištěné vazbě azakoelenterazinu ideálním kandidátem na racionální design dehalogenázy co má i luciferasovou aktivitu,

3. Jakým způsobem se provádí manuální rafinace (refinement) struktury krystalu? (str. 25)

Rafinace probíhá nejprve softwarově, program pro to určený se pokouší strukturu vypočítat dle daných parametrů získaných z naměřených dat. Žádný program ale nedokáže strukturu určit přesně, proto se celá struktura musí v softwarovém programu projít ručně a opravit případné nepřesnosti. Také je nutné doplnit ligandy, vody a jiné molekuly. Poté se spustí opět softwarová rafinace, která vypočítá, jaký vliv na přesnost struktury mají manuálně změněné faktory. Všechny tyto kroky se poté několikrát střídají s cílem vytvořit co nejlépe odpovídající strukturu. Já ve své práci používala soubor programů Phenix a program pro vizualizaci struktury Coop.

4. Z krystalografické studie vyplynulo, že derivát DmmA-H315F krystalizuje jako monomer, ale po „bližším prozkoumání“ vyplynulo, že se jedná o „dokonale prostorově souměrný dimer“. Jak se takové bližší zkoumání provádí? (str. 60)

Opět se využije softwarový program. Lze si totiž nastavit, jestli se člověk dívá pouze na asymetrickou jednotku krystalu (v tomto případě monomer) nebo na více asymetrických jednotek najednou. Při mém konkrétním pozorování byla asymetrická jednotka monomer. To ale nemusí znamenat, že protein je monomer, může být dokonale symetrický dimer. To jsem zjistila tak, že se zobrazí vyšší počet asymetrických jednotek. Celý monomer se zkopíruje a jakoby nahraje do potenciálního druhého monomeru. Jestliže je 100% strukturní shoda, jedná se o symetrický dimer, pokud není, jedná se o protein, který krystalizuje jako monomer.
To, že je DmmA dimer také potvrdila gelová filtrační chromatografie, kdy se protein vyplavuje pouze v jednom peaku v čase typickém pro dimery.

5. Ve videoprezentaci uvádíte, že halogenalkandehydrogenázy se využívají i k dekontaminaci. V případě jakých kontaminací je vhodné volit tyto enzymy a jaká je jejich hlavní konkurenční výhoda oproti zavedeným dekontaminačním mechanizmům?

Halogenalkandehalogenasy se využívají při dekontaminaci toxických halogenovaných uhlovodíků (např. 1,2-dichloretan, 1-chlorbutan, hexachlorcyklohexan), které jsou častými polutanty v prostředí, do kterého se dostaly kvůli používání organických rozpouštědel a pesticidů.
Velká výhoda halogenalkandehalogenas je jejich vysoká specifita a efektivita odstranění toxických polutantů, které není možné dosáhnout jinými metodami (kterých je navíc velmi málo). Halogenalakandehalogenasy jako takové jsou také velmi snadno regulovatelné a netoxické pro prostřední a při jejich použití nedochází ke vzniku nějakých dalších potenciálně nebezpečných produktů.

6. Uvádíte, že v rámci práce se podařilo (krom jiného) „optimalizovat metodiku pro rekombinantní produkci, purifikaci a krystalizaci halogenalkandehalogenasy DmmA“. Jaké bylo hlavní optimalizační kritérium?

Musela jsem celou metodiku postupně sestavit tak, abych byla schopná získávat krystaly proteinu DmmA reprodukovatelně ve velkém množství a kvalitě. Každý protein je naprosto jedinečný a musela jsem proto najít podmínky, ve kterých budu schopná vyprodukovat co největší množství proteinu, který bude mít zároveň vysokou čistotu i kvalitu. Proteinová krystalizace totiž potřebuje velké množství vysoce koncentrovaného a vysoce čistého proteinu, což není úplně triviální úkol získat. Musela jsem tak nastavit všechny podmínky (zvolit vhodné pufry, délky i počet opakování jednotlivých procedur), abych takový protein získala.
U krystalizace je cílem optimalizace získat ještě větší, kvalitnější a tvarově použitelnější (monokrystaly) krystaly vhodné pro difrakční analýzu. Toho se dosahuje gradientem krystalizačních podmínek nalezených při prvotním screeningu, změnou koncentrace protein:precipitant aj. Po několika kolech optimalizace je tak člověk schopen lépe upřesnit podmínky, ve kterých protein krystalizuje.

7. Dehalogenázová aktivita je poměrně obecná pro nejrůznější halogenderiváty. Nicméně, stérické nároky různých organických halogenderivátů jsou různé. V konzervované katalytické pentáze jsou navíc přítomny spíše hydrofilní aminokyseliny, které by neměly mít velkou afinitu k samotným vstupním halogenderivátům, ale spíše stabilizují produkty hydrolýzy. Lze zobecnit, jakým způsobem (ze stereochemického hlediska) se do aktivního centra enzymu váže hydrolyzovaný substrát?

Zde velmi záleží na konkrétním enzymu a velikosti aktivního místa. Například u DmmA vůbec nedochází k reakci ani stabilizaci halogenovaných derivátů (a tedy i produktů) s krátkým řetězcem. Naopak skvěle reaguje s těmi dlouhými, případně aromatickými.
Ke stabilizaci produktu dehalogenasové reakce ale obecně dochází u všech halogenas ve stejném místě v blízkosti Asp144, kde vzniká vodíkový můstek s OH skupinou produktu. Produkt je ale poměrně daleko od aminokyselin His315 a Glu168. Oproti tomu navázaný kovalentní intermediát reakce je v blízkosti celé katalytické triády, tedy i aminokyselin His 315 a Glu 168. Díky této skutečnosti se dá také poměrně dobře ve struktuře poznat, jestli se jedná o navázaný kovalentní intermediát (u kterého je navíc přítomná esterová vazba na Asp144) nebo již o produkt, který je od katalytických aminokyselin vzdálený.
Tyto informace se ale týkají pouze produktů při klasické dehalogenasové reakci, v případě laktonů a azakoelenterazinu je vazba do aktivního místa naprosto specifická a odlišná od vazby halogenovaných uhlovodíků.