Hlavní stránka Fóra Forum pro soutěžící SOČ Obhajoby – Zlínský 42 – kraj ZL – obory 03, 06 Odpověď na téma: 42 – kraj ZL – obory 03, 06

#22517
Hana Bernhardová
Host

Dobrý den,

moc děkuji za Vaše dotazy. Pokusím se na ně co nejlépe odpovědět.

1) Krystalizace enzymů je opravdu metodicky velmi náročný proces. Je nezbytné „vychytat“ mnoho různých věcí – zvolit správný expresní systém, vytvořit purifikační systém, ve kterém bude protein dosahovat opravdu vysoké čistoty a výtěžku a v neposlední řadě také najít vhodné podmínky pro krystalizaci proteinu. V každém jednotlivém kroku je toho opravdu hodně, co se musí vyladit a také co se může pokazit. Každý protein se chová naprosto individuálně a krystalizuje v individuálních podmínkách. Najít tu vhodnou kombinaci chemikálií, pH, poměru proteinu s roztokem precipitantu, koncentraci proteinu aj. zabere spoustu času (někdy, zejména u membránových proteinů, i mnoho let). Navíc, fakt, že má vědec krystaly proteinu neznamená, že bude možné je analyzovat. Některé krystaly jsou totiž pro difrakční analýzu naprosto nevhodné. Já jsem měla v rámci své práce velké štěstí, protože se mi podařilo všechny tyto problémy vyřešit a poměrně rychle získat krystaly DmmA vhodné pro difrakční analýzu.

2) Aby byl zjištěn typ inhibice, je nejprve nutné provést analýzu enzymové kinetiky dle Michaelis Mentenové pomocí některého eseje pro enzymovou kinetiku vhodného pro daný enzym a substrát (dá se měřit dle změn fluorescence, tepla vznikajícího při reakci, absorbance, luminiscence aj.). V mém případě je naprosto ideální měření kinetiky pomocí intenzity fluorescence, jelikož enzym reaguje přímo s fluorescenčním substrátem BODIPY. Bylo by třeba provést analýzu enzymu se substrátem bez inhibitoru a pak analýzu enzymu se substrátem i s inhibitorem v různých koncentracích. Pro zjištění typu inhibice je pak nejlepší dvojnásobně reciproký výnos dle Lineweavera a Burka, kde je rozdíl typů inhibice dobře vidět. Kompetitivní inhibice na rozdíl od nekompetitivní neovlivňuje Vmax ale pouze Km, což je na tvaru křivek na výsledném grafu jasně patrné.

3) Kompetitivní inhibice je jev, kdy molekula inhibitoru „soutěží“ s molekulou substrátu o místo v aktivním místě enzymu. Jedná se tedy o strukturně podobnou látku se substrátem, která se umí s určitou afinitou navázat do aktivního místa, kde ale zůstane, enzymatická reakce neprobíhá a inhibitor tak blokuje aktivní místo pro skutečný substrát. Změnou koncentrací inhibitoru a substrátu lze velmi efektně ovládat rychlost enzymatické reakce. Kompetitivní inhibitory jsou tak velmi cenné jako léčiva nebo regulátory enzymů v biotechnologiích a průmyslu.

4) Tyto metody u malých molekul využity nebyly, protože halogenalkandehalogenasy reagují s takovými molekulami běžně. Proto ve studii mého kolegy, který měřil aktivitu enzymu DmmA vůči různým typickým substrátům halogenalkandehalogenas (halogenované uhlovodíky různých délek) byl zvolen tradiční set substrátů, který se u této rodiny enzymů běžně používá. Bylo samozřejmě zjištěno, že DmmA reaguje díky velikosti svého aktivního místa lépe s těmi delšími substráty. Při zjišťování možné afinity netradičních substrátů s nejistým výsledkem (BODIPY, laktony, azakoelenterazin) ale molecular docking využit byl. Ukázalo se, že by se tyto molekuly mohly do aktivního místa některých halogenalkandehalogenas navázat a to jsem následně ověřovala já experimentálně.